Review - Pathos

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Review

 Pathos 2016; 23; 1. Online 2016, Feb 16
Le proteine coinvolte nella modulazione del dolore:
TRPV1, NGF, OPR e GABA B
The proteins involved in pain modulation:
TRPV1, NGF, OPR and GABA B
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Francesco Amato
Direttore UOC Terapia del Dolore e CP Azienda Ospedaliera Cosenza,
Centro Hub Regionale
Erminia Gilda Morrone
Biologa, Associazione Centro Studi Terapia del Dolore, Cosenza
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Riassunto I TRPV1 sono conosciuti come canali ionici che trasducono i segnali potenzialmente dannosi in una depolarizzazione elettrica a livello delle terminazioni dell’afferente primario. Recenti studi hanno evidenziato come esista un chiaro crosstalk funzionale e strutturale  tra i TRPV1 e l’ANO1 che interviene nell’azione analgesica della capsaicina. Attraverso una serie di pathways intracellulari il NGF incrementa il numero dei TRPV1 a livello delle fibre nervose sensoriali (con l’incremento della p38 e del mRNA) e sensitizza lo stesso canale recettoriale. L’attivazione del MORs causa un decremento dell’attività  della PKA (Proteina Kinasi K), responsabile della fosforilazione dei residui S502, S 800 dei TRPV1 (Recettori  della capsaicina) che trasducono gli impulsi nocivi.
Recenti studi biochimici, inoltre, hanno mostrato che i TRPV1 e i GABA B1 sono chiaramente connessi a livello dei neuroni  DRG. La presenza del GABA B1 con i canali TRPV1 può cambiare la corrente indotta dalla capsaicina. TRPV1, NGF, OPRs, and GABA B sono i nuovi target terapeutici coinvolti nel dolore.
Summary TRPV1 is well known as a sensor ion channel that transduces a potentially harmful environment into electrical depolarization of the peripheral primary afferents terminals. Recent studies have shown a clear structural and functional crosstalk between the TRPV1 and ANO1, which intervenes in the analgesic action of capsaicin. Through a series of intracellular signaling pathways, NGF increases the number of the TRPV1 on the sensory nerve fibers (by increasing the p38 and mRNA) and sensitizes the same receptor channel. The activation of the MORs causes a decreased PKA’s activity (Protein Kinase A), responsible for phosphorylation of residues S 502, S 800 of TRPV1 (Transient Receptor Potential channels) which transduce noxious impulses. In addition, recent biochemical studies have shown that the TRPV1 and GABA B1 are closely linked in DRG neurons. The presence of GABA B1 with channels TRPV1 can change the currents induced by capsaicin. TRPV1, NGF, OPRs, and GABA B are new therapeutic targets involved in pain.
Parole chiave  modulazione del dolore, capsaicina, proteine, TRPV1, NGF, OPR, GABA B
Key words  pain modulation, capsaicin, proteins, TRPV1, NGF, OPR, GABA B

Introduzione
Gli intimi meccanismi neurochimici coinvolti nella genesi del dolore non sono a oggi completamente noti. Nonostante i progressi significativi sulla comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della trasduzione sensoriale e nocicettiva, la gestione del dolore clinico resta una sfida considerevole nella cura della salute e nella ricerca di base. Lo sviluppo e l’'efficacia delle strategie terapeutiche richiede comunque una maggiore conoscenza dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della patogenesi dei disordini cronici causati da una diretta conseguenza di una lesione o di una “sofferenza” di quelle strutture del sistema nervoso che normalmente producono “segnali”. I recenti progressi delle neuroscienze indicano come interessanti possibilità nuovi bersagli farmacologici quali TRPV1, NGF, OPRS, e GABA B che potrebbero costituire nuove opportunità terapeutiche per alleviare il dolore.

I TRPV1
I TRPV1 costituiscono un sottogruppo distinto di canali cationici non selettivi (Transient Receptor Potential) responsabili di molte risposte cellulari. Sono attivati da diversi stimoli come acidi, protoni extracellulari, alte temperature, tossine di piante e agonisti vanilloidi. I TRPV1 presenti nei  mammiferi possono essere considerati  dei  sensori di sostanze chimiche (capsaicina), termiche (calore) e/o di stimoli nocivi. L'attivazione del TRPV1 porta alla depolarizzazione necessaria alla   propagazione dei potenziali d'azione lungo gli assoni dei gangli delle radici dorsali (DRG) dei neuroni che proiettano al midollo spinale. Ciò che rende il TRPV1 così critico per la segnalazione del dolore è innegabilmente la sua capacità di trasdurre segnali infiammatori in segnali elettrici con l'attivazione dei canali del sodio e del calcio entrambi voltaggio-dipendenti localizzati a livello dei nocicettori.1  L'implicazione dei TRPV1 nel dolore patologico ha spinto un accurato studio delle suddette proteine. L’elemento limitativo nella ricerca farmacologica a livello applicativo  è stata la peculiarità del canale TRPV1 cioè il suo meccanismo polimodale di attivazione (calore, capsaicina, pH) che ha portato a un alto livello di complessità nella progettazione di un inibitore a modalità specifica. Un approccio alternativo per lo sviluppo di nuovi analgesici potrebbe consistere nel puntare a una molecola che interagisca all'interno dei nanodomini del suddetto canale che influenza il potenziale d'azione.
Recenti studi hanno mostrato come i TRPV1 interagiscano anche con strutture molecolari   di segnalazione , tra cui la proteina calmodulin legante il calcio,2 l’A-proteina chinasi di ancoraggio,3 la beta-arrestina4 e le proteine del citoscheletro5 per citarne alcune. Il TRPV1, inoltre, interagisce con i recettori accoppiati a proteine G, quali i canali ionici6 e il recettore GABA B.7
Un interessante studio del gruppo Tominaga estende l'elenco delle interazioni del  TRPV1 anche all’Anoctamina 1 (ANO 1) conosciuta anche come TMEM16A:8 un canale del cloro che di solito è attivato dal Ca2 +. Gli autori dimostrano, infatti, che quando il TRPV1 interagisce con il canale ANO1 esso media l’efflusso del Cloro evocando la depolarizzazione (dopo stimolazione della capsaicina) con accresciuta eccitabilità del nocicettore. Tominaga8 ha evidenziato un chiaro crosstalk sia strutturale sia funzionale tra i TRPV1 a l’ANO1, che interviene nell’azione algogenica della capsaicina.
Questi risultati dimostrano l’importanza dell’omeostasi del cloro nella regolazione dell’eccitabilità dei DRG neuronali cioè dei gangli delle radici dorsali e nel fenomeno dolore in toto; uno dei  nuovi approcci, dunque, dove intervenire nel mitigare  l’ipersensibilità dolorosa e l’infiammazione neurogenica.
 
Il Nerve Growth Factor (NGF)
Le modalità di azione del NGF e il suo coinvolgimento nel fenomeno dolore è stato osservato  in  recenti  studi  condotti su cellule cancerogene nel distretto osseo. In condizioni fisiologiche  l'osso è densamente innervato dalle  fibra sensoriali  mieliniche e amieliniche e da fibre simpatiche che normalmente non si trovano nelle immediate vicinanze le une con le altre. E’  stato dimostrato, tuttavia,  che le cellule tumorali possono indurre riorganizzazione e generazione  di entrambi i tipi di fibre, causando non solo un generale aumento della loro densità, ma anche la formazione di neuroma e un intreccio anomalo delle stesse, che contribuisce a uno spontaneo  episodio  di dolore ectopico. E’ stato suggerito che la vicinanza anormale delle fibre sensoriali e simpatiche faciliti l'eccitazione dei neuroni  con  il rilascio di vari  fattori nocicettivi quali il NGF (il fattore di crescita nervoso) e le cellule tumorali associate.9  Jimenez-Andrade e collaboratori10 hanno evidenziato nelle cavie come  la somministrazione preventiva di anti-NGF può attenuare sia la gemmazione e conseguente formazione del neuroma diminuendone  il comportamento nocicettivo.
Il NGF per di più sembra  avere varie azioni pronociceptive oltre al rimodellamento delle fibre nervose periferiche. Mediante una serie di vie di segnale intracellulare, il NGF può aumentare sia l'espressione del TRPV111 sui nervi sensoriali (mediante l’aumento della p38 e incremento del’mRNA) che sensibilizzare lo stesso canale recettoriale  (mediante  attivazione della PKC epsilon e conseguente fosforilazione dei residui S 502 e S 800 del TRPV1).11-12
Il NGF e il suo recettore , neurotrofico tirosina chinasi di tipo 1 (TrkA), inoltre,  formano un complesso che può essere trasportato con andamento retrogrado dai terminali periferici al corpo cellulare situato nel ganglio della radice dorsale (DRG), dove può dare inizio alla sintesi di neurotrasmettitori (il peptide P correlato al gene della calcitonina),  all’espressione di recettori e di canali (recettore bradichinina, P2X3, TRPV1, ASIC3 e canali del sodio),13 ai fattori di trascrizione (Attivazione del fattore di trascrizione 3-ATF-3) nonché a molecole strutturali (neurofilamenti e canale-ancoraggio del sodio e molecola p11).
Per giunta il NGF modula il traffico e l'espressione di canali del sodio voltaggio-dipendenti (Nav).14 Di recente  è stato testato con successo il tanezumab, un anticorpo monoclonale anti-NGF, utilizzato in clinica per il trattamento di pazienti con osteoartrite agli arti inferiori e mal di schiena, anche se a esso si sono col tempo associati effetti collaterali; tuttavia l’anti-NGF potrebbe  essere un  potenziale trattamento  per i malati di cancro.15
Per inciso bisogna considerare come  i recettori P2X3   e TRPV1, che hanno un effetto sul comportamento complessivo del dolore, sono quei  canali  altamente espressi sui neuroni sensoriali periferici, sia a livello della  terminazione  periferica che a livello del   corpo e sono quelli che sono modulati dall’azione del NGF.
Tradizionalmente, i nocicettori erano classificati sulla base dell’ espressione di specifici canali ionici e recettori, come il Nav1.7 e Nav1.8, ed è generalmente accettato che oltre il 90 per cento dei nocicettori esprimono Nav1.8. Tuttavia, nello studio di Minett et al16 è stato dimostrato che la normale funzione dei neuroni Nav1.7- e Nav1.8-positivi non era fondamentale per lo sviluppo del dolore, ma per la propagazione del segnale indotto dalle proteine recettoriali preposte alla trasduzione della noxa patogena. Questo potrebbe essere uno degli elementi chiave per comprendere il motivo per cui le tradizionali terapie analgesiche non  riescono in modo efficace  nel trattamento di  pazienti oncologici con dolore osseo metastatico.
In conclusione, i futuri approcci terapeutici che sembrano essere promettenti nel trattamento sia del dolore osseo indotto da cancro sia nel dolore cronico osteoartritico che condividono stati patologici comuni (il rimodellamento osseo, l’angiogenesi e la crescita nervosa) riguardano la componente neuropatica e includono:
-il Nerve Growth Factor (NGF)
-i canali del sodio voltaggio dipendente (VGSC)
-i canali del calcio voltaggio dipendente (VGCC)
-i recettori (TRPV1)

I recettori degli oppioidi
I recettori Mu (MOR), il cui maggiore agonista è la morfina, costituiscono la più potente via analgesica nel trattamento del dolore moderato e severo.17,18  Le suddette  proteine recettoriali  presentano sette domini transmemebrana e sono accoppiate alle  proteine  G eterotrimeriche, legate  a esse sul lato citoplasmatico della membrana cellulare: per questo i 7TMR sono anche chiamati GPCR (G-Protein Coupled Receptors).19 Le tre subunità delle proteine G sono dette Gα, Gβ e Gγ. L’attivazione dei MORs, mediante la variazione conformazionale  della subunità  Gα ,inibisce l’attività enzimatica dell’Adenylate Cyclase di conseguenza diminuiscono i livelli di cAMP. (Figura 1).
Ciò induce una diminuita attività anche della PKA ( Protein Kinase A) preposta alla fosforilazione dei residui S 502, S 800 dei TRPV1 , che trasducono gli impulsi nocivi.20-21 La subunità Gα, inoltre, stimola l’efflusso del potassio, mentre la subunità Gβ blocca l’entrata dello ione Calcio2+ diminuendo la capacità della cellula  di trasmettere l’impulso nervoso ai centri superiori.22-25 (Figura  2 (a-b)).
Le subunità Gβ e Gγ attivano, inoltre,  anche la fosfolipasi C (PLC) con conseguente produzione dei secondi messaggeri quali l'inositolo 1,4,5 trisphosphate (InsP3) e il diacylglycerolo (DCG), che attiva la PKC (Fosfochinasi C)26,27 esercitando così un'azione, in questo caso, stimolatrice sui recettori purinergici P2X3. Ciò determina un'azione antinocicettiva degli oppioidi mediante la loro azione sui P2X3 receptors, anche se è stata registrata un'azione dicotomica degli oppioidi sui recettori P2X3 (mediante la degradazione a opera della PLC del PIP2 quando quest’ultima molecola si presenta in diretto contatto con il suddetto recettore). Se l'azione degli oppioidi si prolunga nel tempo, invece, si attiva la seconda modalità di risposta con effetti pronocicettivi.28-29  Scoprire l'interruttore che regola il fenomeno permetterà ovviamente di individuare lo sviluppo di terapie antinocicettive. Oltre ciò bisogna porre l'attenzione  anche su interessanti studi  che hanno evidenziato  la presenza dei recettori per gli oppioidi  a livello della microglia e sembrano essere i protagonisti dell’iperalgesia indotta dalla loro prolungata  somministrazione (OIH). Gli oppioidi, infatti, quando interagiscono con i propri recettori (μ) localizzati a livello della microglia30 promuovono l’attivazione dei P2X4Rs, 31 che innescano la sintesi e il rilascio (a livello  della microglia) del Fattore Neurotrofico BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor). Esso legandosi poi ai recettoriTrKB, provoca, in una sottopopolazione cellulare della lamina superficiale del corno dorsale (II neurone), un cambiamento nel gradiente transmembrana di anioni, alterando l’omeostati del cloro e
downregolando il potassium-chloride transporter KCC2 attraverso la via TrkB. Il fenomeno causa così un incremento del cloro [Cl-] intracellulare e  l’azione del GABA risulta pertanto ipereccitante.32
Questa serie di eventi è stata avvalorata dai risultati di uno studio effettuato su cavie transgeniche in cui l’espressione della proteina BDNF era stata geneticamente soppressa solo nella microglia, ove, infatti, non si registrava più la produzione delle neurotrofine (BNDF) e la somministrazione prolungata di morfina non induceva l’iperalgesia (OIH-  iperalgesia indotta dagli oppioidi).33  
Affrontare il multiforme universo delle interazioni degli degli oppioidi nei distretti microglia-neuroni e conoscerne i meccanismi molecolari sottostanti offre l’opportunità di identificare potenziali bersagli per nuovi approcci terapeutici, soprattutto per prevenire l’iperalgesia indotta dalla morfina senza interferire col suo effetto analgesico.
 
Il GABA B
Il GABA (Gamma-AminoButyric Acid) è il più importante neurotrasmettitore inibitorio del sistema nervoso centrale (SNC).34 Recenti studi hanno evidenziato come il GABA sia rilasciato a livello dei terminali periferici per invertire la sensibilizzazione dei TRPV1 e alleviare il dolore infiammatorio. La sensibilizzazione del recettore TRPV1 è un fenomeno fondamentale per l'avvio di forme patologiche di dolore.35 I fattori che ne mediano il processo di fosforilazione del canale sono il NGF, la bradichinina e la serotonina. Ciascuno dei tre mediatori attiva un insieme separato di molecole di segnalazione che convergono sulla proteina chinasi C (PKC) sensibilizzando il canale attraverso la fosforilazione diretta del recettore. La sensibilizzazione aumenta l'attività dei canali TRPV1, che porta un aumento del flusso del calcio.
Recenti studi biochimici hanno evidenziatore come i TRPV1 e i GABA B1 siano strettamente associati nei neuroni DRG. La presenza di recettori GABA  B1 con i canali TRPV1 può modificare le correnti indotte dalla capsaicina.35 Studi condotti sulle terminazioni nervose libere nella pelle di topi reporter hanno, altresì, evidenziato una co-localizzazione dei TRPV1 e dei GABA B1 sostenendo ulteriormente l'idea che il GABA modula i TRPV1 a livello dei terminali periferici (Figura 3).
I ricercatori pertanto propongono un modello in cui la sensibilizzazione dei TRPV1 è tenuta sotto controllo dal GABA che viene rilasciato in risposta all'attivazione dei TRPV1. A questo punto ci siamo chiesti: la dannosa escalation dell'attività dei TRPV1 può essere contrastata?
Utilizzando un approccio genetico-proteomico, è stato identificato come la subunità del recettore GABA B1 sia un efficace inibitore della sensibilizzazione dei TRPV1 in diversi contesti infiammatori.  Il GABA B agonista endogeno del GABA liberato dalle terminazioni nervose nocicettive suggerisce un meccanismo di feedback autocrino che limita i processi di sensibilizzazione dei TRPV1.36 L'effetto di GABA B su TRPV1 è indipendente dalla canonica segnalazione legata alla proteina ​​G; si basa piuttosto sulla stretta giustapposizione della subunità del recettore GABA B1 sul  TRPV1. E' stato osservato, inoltre, come attivando il recettore GABA B1, esso non attenui il normale funzionamento del recettore capsaicina ma influenzi esclusivamente il suo stato di sensibilizzazione.37 Il fatto che il GABA  sembra non modulare la funzione TRPV1 basale può essere particolarmente importante per le applicazioni terapeutiche. Sfruttando questo meccanismo per la terapia anti-dolore si possono evitare gli effetti avversi associati attualmente al blocco dei TRPV1. I nuovi bersagli farmacologici, in cui gli oppioidi abilmente fanno da protagonisti nell’inibizione della trasmissione dei messaggi dolorifici, aprono nuovi orizzonti e nuove possibilità. Resta la necessità di abbandonare i vecchi schemi e adattare i piani di ricerca alle nuove vie che i recenti progressi delle neuroscienze indicano come interessanti possibilità. Sicuramente il successo non sarà né facile né celere, ma i nuovi farmaci saranno sviluppati seguendo nuovi schemi che tengano conto dei presupposti che la ricerca di base sta continuamente delineando e chiarificando.

Pubblicato il 16 febbraio 2016
Bibliografia

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